现代显微成像技术的基石，建立在去除荧光在样品中的散射技术上，典型如共聚焦、多光子、光片成像、三维结构光、组织透明化等。然而，基于光学的层切技术常常会带来系统成本、成像时间与光毒性的提高，基于生物的层切技术又会带来样品处理复杂性的提高。此外，即使是最先进的光学成像技术，在面对深层样本的成像中，依然会由于深层散射而产生离焦背景，影响精细生物结构的观察。
为了提升各种场景下荧光成像的光学层切性能，我院生物医学光子学研究中心屈军乐/北京大学席鹏合作团队另辟蹊径，通过计算机视觉与荧光显微的融合提出了一种暗通道光学层切算法（Dark sectioning），相关成果在Nature Methods杂志以长文（Article）的形式发表，题为“暗通道光学层切算法助力荧光图像离焦背景去除”的研究论文。Dark sectioning仅用单帧图像即可高效去除图像的离焦背景，使显微成像的信背比（SBR）和结构相似性（SSIM）得到大幅提升，为深部生物组织研究、病理诊断及深层活体动态观测开辟全新可能。
Ø 研究背景：离焦信号成显微成像“拦路虎”
荧光显微镜虽能捕捉细胞动态，但样本散射或离焦区域产生的背景噪声会掩盖关键细节。传统解决方案如共聚焦显微镜、结构光成像等技术虽有效，却需复杂硬件或牺牲成像速度；而现有算法（如去噪、反卷积）难以精准区分焦点内外信息，易导致弱信号丢失或产生图像伪影。
Ø 核心技术：灵感来自“图像去雾”，单帧实现高精度光学切片
研究者从自然图像的暗通道去雾中获得灵感，融合暗通道先验与双频分离原理（图1）：
² 暗通道先验：聚焦区域的暗通道值趋近于零，而离焦背景呈现非零波动，借此精准区分焦点内外信息，广泛应用于自然图像去雾任务中。
² 双频分离：将图像分解为高频（细节）和低频（背景）成分，仅处理低频部分以保留弱信号，最终融合生成高质量图像。
图1. （a, b）自然图像与离焦图像的暗通道先验处理结果，（c）点拓展函数的大小差异导致暗通道图像差异，以及（d）Dark sectioning处理前后的图像对比。比例尺：4 μm。
首先，通过双频分离以保留图像的弱小信号，仅对图像的低频部分进行背景去除，并利用点扩展函数优化图像块尺寸，采用更低一级的低通滤波器模拟初始背景，最后通过单次或多次迭代去除背景以适用不同的成像场景。通过宽场-共聚焦，宽场-光层切，二维-三维结构光，单光子-双光子的联合交叉验证（图2），结果表明，Dark sectioning技术将SBR提升近10 dB，SSIM提高约10倍，效果媲美共聚焦显微镜，且适用于宽场、双光子、光片显微镜等多种成像模式，甚至能优化现有算法（如去卷积、超分辨成像），减少伪影。
图2. 交叉验证证明Dark sectioning技术的保真性能。（a）霉菌样本的宽场-共聚焦成像，（b）小鼠肾脏微丝的多模态结构光照明显微成像，（c）小鼠神经元钙成像的单光子-双光子成像。比例尺：（a, b）4 μm。
Ø 应用场景：从脑科学到病理诊断的突破
Dark sectioning技术可应用于不同的生物医学成像场景。在神经科学中，识别被背景掩盖的小鼠脑组织深层神经元，助力脑活动追踪。在病理分析中，对200微米厚的前列腺病理切片，精准分割600多个细胞核，远超传统方法的200个，为癌症诊断提供更清晰依据动态观测。此外，支持活细胞长时间成像，实时捕捉内质网、线粒体等动态过程，且无需复杂硬件升级（图3）。
图3. Dark sectioning的典型应用。（a）基于光片的小鼠全脑成像，（b）小鼠血管的小动物活体成像，（c）合成孔径双光子小鼠神经元成像，（d）前列腺组织三维光片成像与虚拟染色图像。比例尺：（a）40 μm，（b）2 mm，（c）32 μm，（d）8 μm。
Ø 研究意义：低成本、高兼容，推动精准医学发展
Dark sectioning技术打破了传统显微成像在速度、成本与精度间的权衡，它像一款“智能滤镜”，可无缝整合到现有设备中，为生物医学研究提供更经济高效的解决方案。目前，研究团队已开源代码、提供了MATLAB程序/函数，基于Java的Fiji插件（https://github. com/Cao-ruijie/Dark-sectioning）供不同用户测试使用，推动技术普及。未来，该技术或与深度学习结合，进一步革新医学图像分析，为疾病机制研究和临床诊断开辟新路径。
在本项工作中，北京大学未来技术学院席鹏教授、深圳大学屈军乐教授为该论文的共同通讯作者，北京大学未来技术学院博士生曹睿杰和北京大学未来技术学院已毕业的李雅宁博士为共同第一作者，深圳大学生物医学光子学研究中心林方睿、张炜参与了本工作。此外，该工作还得到了华中科技大学费鹏课题组、清华大学吴嘉敏课题组、南方科技大学李依明课题组、北京大学李长辉课题组、北京大学卢闫晔课题组的重要支持与帮助。
本工作得到了科技部重点研发专项、国家自然科学基金等项目的资助。
论文信息：Cao, R., Li, Y., Zhou, Y. et al. Dark-based optical sectioning assists background removal in fluorescence microscopy. Nat Methods (2025). https://doi.org/10.1038/s41592-025-02667-6
